Результаты исследования

Эксперимент выполнен на 80 половозрелых кроликах-самцах в стандартных условиях. Всем животным под общим обезболиванием на спине по паравертебральной линии формировали инфицированные раны мягких тканей. С помощью металлической пластины с внутренним диаметром кольца 2,0 см иссекали шкуру, полученный дефект обрабатывали 70%-ной уксусной кислотой до получения некроза подкожной клетчатки и мышц. Через 3 суток некротический струп удаляли механическим путем и в рану вносили 500 тыс. КОЕ St. Aureus.


Лечение животных начинали через 5 суток после формирования инфицированной раны мягких тканей. Животные были разделены на 4 группы: экспериментальная группа и три группы контроля (по 20 кролов в каждой). В каждой группе 1 раз в сутки края раны обрабатывали раствором Люголя, рану промывали 3%-ным раствором перекиси водорода, осушали, после чего выполняли перевязку с определенным для каждой группы лекарственным веществом.

1. В экспериментальной группе в рану вносили аллогенные прогенеторные клетки в виде геля оригинального состава. После подсушивания и образования пленки из геля на 3-5 минут на рану накладывали сухую стерильную салфетку.

2. Группа контроля № 1 (контроль основы) – в рану вносили только основу геля без клеток-предшественниц.

3. В группе контроля № 2 лечение проводили традиционным методом в зависимости от фазы течения раневого процесса: в фазу воспаления применяли повязки с мазями на водной основе, в фазу регенерации и эпителизации – с мазями на жировой основе.

4. В группе контроля № 3 после обработки на рану накладывалась сухая стерильная салфетка.

На 1, 3, 5, 7, 10, 15 сутки оценивали размеры раневого дефекта, наличие отека, гиперемии, отделяемого из раны и его характер. В эти же сроки под местной анестезией выполняли биопсию раны через все слои на глубину до 1,8-2,2 см. Материал фиксировали в 96%-ном этиловом спирте, заливали в парафин и готовили гистологические срезы, которые окрашивали гематоксилином Майера и эозином с последующим анализом морфологической картины. Парафиновые срезы обрабатывали ферментными иммунными комплексами с проведением внутреннего контроля иммуногистохимических реакций для выявления проапоптотического маркера CD95+ и маркера пролиферации Ki67.

У всех животных были сформированы раны неправильно округлой формы размером 3,9-4,1 см в диаметре. Вокруг раны – очаг инфильтрации до 3,5 см в диаметре. Стенки раны гиперемированы, плотные, спаяны с окружающими тканями, дно покрыто плотным налетом фибрина, выделяется до 2-3 мл гнойного отделяемого белесоватого цвета тестоватой консистенции (рис. 1).

Рисунок 1 Моделирование инфицированной раны мягких тканей.

Глубина раневого дефекта достигает 2 см. При гистологическом исследовании определяются очаги некроза в соединительной и мышечной тканях, расширение кровеносных сосудов со стазом крови, экссудация лейкоцитов. Сосочковый слой дермы имеет четкое разграничение на слои: с выраженной клеточной инфильтрацией, представленной моноцитами, единичными макрофагами и рыхлой соединительной тканью с большим количеством фиброцитов, единичными фибробластами, единичными моноцитами, плазмоцитами (рис. 2). При иммуногистохимическом исследовании во всех группах выявляется высокий уровень CD95+.

Рисунок 2. Характеристика ран до начала лечения. Окраска – гематоксилин Майера и эозин. УвХ 40.

Для лечения животные были разделены на 4 группы: экспериментальная группа (I) – у животных этой группы для лечения были использованы аллогенные прогенеторные клетки и три группы контроля – контроль основы, традиционные методы лечения, без лечения (II, III,IV группы соответственно).

На 1 сутки в экспериментальной группе раневой дефект сохраняет свои размеры (4 ± 0,5 см в диаметре). Вокруг раны сохраняется умеренная гиперемия кожи, стенки раны мягкие при пальпации, дно раны покрыто налетом фибрина, гноя нет. На 3 сутки наблюдается уменьшение размеров дефекта ткани до 0,2-0,3 мм в диаметре, рана покрыта струпом бледно-серого цвета, вокруг располагается очаг эпителизации до 2,5-3,0 мм в диаметре. Гиперемия и инфильтрация вокруг раны не определяются. При гистологическом исследовании в ране определяется рыхлая соединительная ткань с небольшой лейкоцитарной инфильтрацией, единичными укрупненными фибробластами, лимфоцитами, плазмоцитами, эозинофилами и моноцитами. Очаги пролиферации эндотелия сосудов без просвета, с многорядностью расположения ядер. На 5 сутки дефект кожи отсутствует, определяется очаг эпителизации до 2 см в диаметре (рис. 3). Микроскопически поверхность покрыта многослойным плоским эпителием, подэпителиально определяется лимфоплазмоцитарная инфильтрация (рис. 4).

                                 

Рисунок 3. Группа I. 5 сутки эксперимента.      Рисунок 4. Группа I. 5 сутки эксперимента. Окраска – гематоксилин Майера и эозин. УвХ 90

На 10-15 сутки эксперимента констатирована полная эпителизация раневого дефекта с его оволосением (рис. 5). Гистологически отмечается пролиферативная активность клеток фибробластического ряда, трубчатая пролиферация фибробластов и эндотелия сосудов. В подкожной клетчатке определяются неповрежденные нервные стволики, что соответствует гистологической картине эпителизации раны с сохранением всех функционирующих структур (рис. 6).

                                 

Рисунок 5. Группа I. 10 сутки эксперимента.     Рисунок 6. Группа I. 10 сутки эксперимента. Окраска гематоксилин Майера и эозин. УвХ 20.

Во всех группах контроля на 1 сутки раны также сохраняют свои размеры. При этом стенки ран сохраняют свою плотность, спаяны с окружающими тканями, вокруг раны сохраняется плотный инфильтрат, при механическом воздействии из раны выделяется гной, дно раны покрыто гнойной пленкой.

У животных II группы раны сохраняют свои размеры до 10 суток эксперимента, при гистологическом исследовании определяются отек, лимфогистиоцитарная инфильтрация и дистрофически-дегенеративные изменения подкожной клетчатки, мышечного слоя (рис. 7). Закрытие раневого дефекта к 22-25 суткам эксперимента не происходит (рис. 8). Как видно на фото, в эти сроки несколько сокращаются размеры раневого дефекта (1,6-1,9 см в диаметре), рана покрыта налетом фибрина, края и стенки раны плотные.

Рисунок 7. Группа II. 5 сутки эксперимента. Окраска – гематоксилин Майера и эозин. УвХ 20.

Рисунок 8. Группа II. 25 сутки эксперимента.

До начала лечения во всех группах наблюдаются признаки некроза мягких тканей в ответ на прямое воздействие повреждающего агента (травма + инфицирование) с замещением очагов некроза полиморфно-ядерными лейкоцитами, при этом также определяются и мононуклеарные лимфоциты. В экспериментальной группе после применения ранозаживляющего средства Cellgel очищение раны от гнойно-некротических тканей происходит на 1-3 сутки лечения, а эпителизация раневого дефекта заканчивается к 5-7 суткам эксперимента, с восстановлением волосяного покрова. В группах контроля очищение раны от гнойно-некротических тканей происходит к 15-20 суткам, закрытие раневого дефекта с формированием грубого соединительно-тканного рубца – к 20-30 суткам. Клинический эффект применения ранозаживляющего средства Cellgel позволяет сделать вывод об индуцирующем влиянии аллогенных прогенеторных клеток на течение процессов репаративной регенерации.

Уровень Ki67 инфицированных ран мягких тканей экспериментальных групп до лечения.